NIH 3T3 NIH 3T3細胞 atcc標準菌株

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　　基因敲除技術(shù)是20世紀80年代發(fā)展起來的，是建立在基因同源重組技術(shù)基礎(chǔ)以及胚胎干細胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新分子生物學(xué)技術(shù)。基因敲除就是通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù)。本文對三種基因敲除技術(shù)作比較，描述它們的優(yōu)缺點。

　　基于胚胎干細胞的同源重組技術(shù)　　1、優(yōu)勢：成熟、可靠、精細是目前為止*一個可以滿足所有要求的打靶技術(shù)　　2、局限性：　　A 需要ES細胞，目前只有小鼠有的ES細胞，其它模式動物的ESC還不能實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用。　　B 周期長、工作量大、費用相對比較高　　3、可提供服務(wù)類型：　　A 全基因敲除模式小鼠　　B 條件性基因敲除模式小鼠　　C 先全敲除再條件性敲除模式小鼠　　D 基因敲入模式小鼠

　　E ROSA位點定點轉(zhuǎn)基因　　TALEN技術(shù)　　1、優(yōu)勢：基因敲除效率高，速度快，可實現(xiàn)多物種基因敲除

　　2、局限性：　　基因敲入效率較低，多基因敲除困難，系統(tǒng)構(gòu)建相對復(fù)雜，存在脫靶風(fēng)險

　　3、可提供服務(wù)類型：　　A 全基因敲除大/小鼠　　B 全基因敲除細胞系

　　EGE系統(tǒng)　　1、優(yōu)勢：基因敲除/敲入效率高，速度快，可實現(xiàn)多基因、多物種基因敲除/敲入，系統(tǒng)構(gòu)建簡單　　2、局限性：　　存在脫靶風(fēng)險，但通過選擇合適的sgRNA可以有效降低脫靶率，In vivo脫靶可通過傳代去除.　　3、可提供服務(wù)類型：　　A 全基因/條件性基因敲除大/小鼠　　B 全基因/條件性報告基因敲除/敲入大/小鼠　C CRISPR/Cas9粒構(gòu)建　　D 細胞系敲除/敲入

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　　研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。胎牛血清使用錯誤或胎牛血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80℃太久。

　　研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

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　　 快速識別與處理常見細胞污染的招術(shù)：

　　1、細菌：　　識別：細菌在顯微鏡下為黑色細沙狀，根據(jù)感染細菌的不同，可有不同的外形，有球形，鏈形，桿形等。大家不必深究。只要發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液渾濁變黃，培養(yǎng)瓶頂部有一層細沙一樣的東西。就知道大事不好啦。　　處理：可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理。可以用四環(huán)素，慶大霉素，或者鏈霉素，前兩者的工作濃度是50 μg/mL;鏈霉素的工作濃度是100 μg/mL。其實，毛毛蟲說句實話，一旦發(fā)生污染，就已經(jīng)大勢已去了。如果細胞不是特別特別珍貴的話，還是趁早扔了，重起爐灶吧。所以，zui重要的還是防范于未然。做好培養(yǎng)間，CO2孵箱，器皿和培養(yǎng)液的消毒滅菌工作。在操作的時候，嚴格執(zhí)行無菌操作規(guī)范。

　　2、霉菌：　　識別：因為培養(yǎng)液是清亮的，所以霉菌污染非常難以早期發(fā)現(xiàn)，等發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)為時過晚了。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物，如同風(fēng)中柳絮。細胞仍可生長，但時間一長，細胞的狀態(tài)就變差。　　處理：細胞一旦被霉菌污染，很難挽救，兩性霉素B或制霉菌素都于事無補，建議果斷舍棄該污染細胞，將環(huán)境*消毒。

　　采用酒精*底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新潔爾滅擦洗一遍。把水盤里加上飽和量的硫酸銅。

　　3、支原體：　　識別：多為多邊形，培養(yǎng)液一般會變渾濁。支原體感染細胞以后，細胞病變不很明顯，只是和你一起慢慢變老。支原體污染后，可影響所有的細胞生長參數(shù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之數(shù)據(jù)方有意義。　　處理：沒有什么好處理的。直接扔了吧。污染到其他的細胞就虧大發(fā)了。還是那句話，預(yù)防為主。

　　4、黑蛟蟲：　　識別：誰都不知道所謂的“黑膠蟲”是什么東西。據(jù)說是納米級的細菌。低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響。但是如果太多了，也會影響細胞生長和實驗結(jié)果。　　處理：因為根本不知道這是什么物種，所以也談不上什么處理方式。建議如果細胞有可能是此種污染的話，可以增加細胞的種板密度，以提高細胞的生存率。

　　5、真菌：　　識別：真菌污染和霉菌污染差不多。一般培養(yǎng)液清亮，所以很難早期發(fā)現(xiàn)。鏡下有時候象絲狀，有時候象珊瑚狀。慢慢地會長出很細的黑色絲狀物。這個時候，已經(jīng)晚了，細胞很難救活了。

　　處理：同霉菌污染一樣，沒有什么好處理的，直接扔了吧。然后*消毒滅菌培養(yǎng)間，CO2孵箱，器皿和培養(yǎng)液。

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